導(dǎo)讀：近日，國(guó)際知名期刊《Advanced Drug Delivery Reviews》（IF=15.606）發(fā)表的綜述文章，對(duì)目前實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的核酸突變分析方法進(jìn)行了介紹，來(lái)自美國(guó)萊斯大學(xué)的DmitriyKhodakov教授認(rèn)為，在未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)PCR技術(shù)仍然是核酸突變位點(diǎn)檢測(cè)的不二選擇，其中在PCR技術(shù)領(lǐng)域，艾德生物ARMS技術(shù)獲得國(guó)際認(rèn)可，成為綜述中提及的中國(guó)公司。以下是《生物谷》原文。
核酸突變分析方法抉擇：PCR、雜交、NGS？
日前，以"精細(xì)管理、精準(zhǔn)醫(yī)療"為主題的2016屆CSCO學(xué)術(shù)年會(huì)在廈門(mén)落下帷幕，精準(zhǔn)檢測(cè)作為臨床實(shí)踐中實(shí)施精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的第一步，成為本屆CSCO學(xué)術(shù)年會(huì)的熱點(diǎn)話(huà)題。來(lái)自不同企業(yè)的分子診斷技術(shù)百花齊放百家爭(zhēng)鳴，面對(duì)新技術(shù)與成熟技術(shù)的較量，在"精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)"時(shí)代下，如何選擇合適的檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療成為新醫(yī)學(xué)形態(tài)下人們亟需解決的問(wèn)題。
近期，美國(guó)萊斯大學(xué)DmitriyKhodakov教授在國(guó)際知名期刊《Advanced Drug Delivery Reviews》（IF=15.606）發(fā)表的綜述文章，也許能給我們一個(gè)答案。該文對(duì)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)關(guān)鍵的基因檢測(cè)技術(shù)手段進(jìn)行了梳理，作者認(rèn)為目前實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的核酸檢測(cè)技術(shù)可以分為三大類(lèi)：PCR技術(shù)、雜交技術(shù)和測(cè)序技術(shù)，介紹了這三類(lèi)技術(shù)，并對(duì)其臨床應(yīng)用發(fā)表了自己的見(jiàn)解。以下是對(duì)該文主要內(nèi)容的介紹。
一、PCR技術(shù)
PCR技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用的DNA分子檢測(cè)技術(shù)。與雜交技術(shù)和測(cè)序技術(shù)相比，PCR技術(shù)優(yōu)勢(shì)主要在于、高敏感度、易于推廣。其主要局限在于多重基因聯(lián)合檢測(cè)時(shí)可涵蓋的基因數(shù)量受限。
1、ARMS
擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（ARMS）是使用廣泛的一種核酸變異檢測(cè)技術(shù)，已有多家公司開(kāi)發(fā)出基于此技術(shù)的腫瘤突變基因檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品，如Qiagentherascreen、Roche Cobas、BiomerieuxTHxID以及中國(guó)的AmoyDx等。
2、Blocker PCR
Blocker PCR技術(shù)通過(guò)引入blocker序列來(lái)抑制野生型基因擴(kuò)增從而達(dá)到檢測(cè)核酸變異位點(diǎn)的目的。目前已有基于此技術(shù)的腫瘤基因突變檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品問(wèn)世，如PNA Bio開(kāi)發(fā)的PNAClamp試劑盒。
3、多重PCR
多重PCR技術(shù)需要解決擴(kuò)增抑制、熒光基團(tuán)的數(shù)量限制、引物二聚體等問(wèn)題，其工程學(xué)解決方案主要通過(guò)開(kāi)發(fā)設(shè)備和一次性芯片等來(lái)解決。Biofire Diagnostics(現(xiàn)被Biomerieux收購(gòu))和Cepheid都開(kāi)發(fā)出用于感染性疾病診斷的多重PCR試劑和儀器。
4、數(shù)字PCR
數(shù)字PCR技術(shù)通過(guò)將一個(gè)樣本分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板)，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而實(shí)現(xiàn)高靈敏的絕對(duì)定量檢測(cè)。目前數(shù)字PCR主要用于科研及臨床研究，也有開(kāi)發(fā)LDT方法用于臨床，如Trovagene PCMBRAFV600E試驗(yàn)。
二、雜交
雜交是一種將合成的DNA探針或引物與目標(biāo)序列結(jié)合的過(guò)程。與PCR技術(shù)和NGS技術(shù)相比，雜交的主要優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、可多重檢測(cè)、結(jié)果可靠，其缺點(diǎn)主要在于該方法不能進(jìn)行序列擴(kuò)增，因此必須依賴(lài)于信號(hào)放大技術(shù)或者高靈敏的檢測(cè)設(shè)備。
1、微矩陣
微矩陣通過(guò)靶基因與固定在芯片上的探針發(fā)生特異性雜交，結(jié)合在芯片上不同位置的探針對(duì)應(yīng)不同突變，熒光強(qiáng)度代表濃度，從而實(shí)現(xiàn)一次檢測(cè)多種基因突變或者基因表達(dá)水平的目的。因此，其檢測(cè)靈敏度取決于靶基因和探針的雜交效率及熒光顯微鏡的分辯能力。FDA已批準(zhǔn)多個(gè)微矩陣技術(shù)產(chǎn)品，如Agendia開(kāi)發(fā)的用于乳腺癌檢測(cè)的MammaPrint試劑盒等。
2、熒光條形碼單分子檢測(cè)技術(shù)
熒光條形碼單分子檢測(cè)技術(shù)是一種高通量檢測(cè)技術(shù)?？煞譃閮纱箢?lèi)：intensity barcodes和geometric barcodes，intensity barcodes在二氧化硅顆粒上標(biāo)記不同密度的熒光標(biāo)記，通過(guò)捕獲有目標(biāo)基因的顆粒的熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)突變類(lèi)型；而geometric barcodes是利用光譜上不同的熒光基團(tuán)的組合來(lái)檢測(cè)不同序列。其中Luminex開(kāi)發(fā)的基于intensity barcodes方法的呼吸道疾病診斷技術(shù)已獲得FDA批準(zhǔn)。
3、原位雜交（ISH）
原位雜交不僅提供目標(biāo)基因的序列和濃度信息，而且可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的細(xì)胞定位，尤其適用于異質(zhì)性細(xì)胞及組織樣本的基因擴(kuò)增檢測(cè)。原位雜交技術(shù)有熒光原位雜交（FISH）、顯色原位雜交（CISH）或者銀染原位雜交（SISH）等，原位雜交技術(shù)可應(yīng)用于DNA和RNA的檢測(cè)，目前，F(xiàn)ISH主要用于DNA擴(kuò)增檢測(cè)，如Roche和Abbot開(kāi)發(fā)的HER2擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒。
三、新一代測(cè)序技術(shù)（NGS）
NGS是一種高通量檢測(cè)DNA和RNA變異的方法，與Sanger測(cè)序不同，NGS可檢測(cè)多種樣本，且可以同步提供大量的基因變異信息，因此該方法非常適合于并行檢測(cè)和分析多種基因和變異信息。
沒(méi)有一種方法是完美的，由于背景信號(hào)干擾、酶的擴(kuò)增錯(cuò)誤率、化學(xué)反應(yīng)不徹底等問(wèn)題，所有的NGS平臺(tái)都有一定的內(nèi)在錯(cuò)誤率。而測(cè)序過(guò)程中的錯(cuò)誤會(huì)增加突變檢測(cè)的難度，特別是低頻突變。
1、主流NGS平臺(tái)
主流NGS平臺(tái)有Illumina和IonTorrent的的NGS系統(tǒng)，Illumina在序列錯(cuò)誤率和成本控制上處于優(yōu)勢(shì)地位。在診斷應(yīng)用方面，Illumina開(kāi)發(fā)有Miseq和NextSeq兩個(gè)平臺(tái)，其中MiseqDx是已獲得FDA許可用于IVD的NGS平臺(tái)。
2、其他平臺(tái)
其他平臺(tái)還有：適用于長(zhǎng)序列檢測(cè)的SMRT NGS平臺(tái)（Pacific Bioscience），以及Nanopores NGS平臺(tái)（Oxford、Genia Technologies）等。
四、作者觀(guān)點(diǎn)
NGS實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜且成本高，由于其高通量的序列分析能力，已經(jīng)成為許多序列變異分析與科研應(yīng)用的主要選擇。然而，從臨床診斷應(yīng)用的角度，檢測(cè)的目標(biāo)位點(diǎn)必須具有明確的臨床價(jià)值，因此相對(duì)于NGS技術(shù)而言，PCR技術(shù)的簡(jiǎn)便性、穩(wěn)定性和使用的廣泛程度意味著在未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)PCR技術(shù)依然是核酸突變位點(diǎn)檢測(cè)的不二選擇。
在可預(yù)見(jiàn)的未來(lái)里，技術(shù)的發(fā)展將扮演重要的角色。雖然NGS技術(shù)單位通量?jī)r(jià)格在近10年極大地降低，但是依然離整個(gè)基因組或轉(zhuǎn)錄水平的全面深度測(cè)序至少6個(gè)數(shù)量級(jí)的差距。DNA序列變異分析的優(yōu)化和創(chuàng)新將主要集中在價(jià)格，準(zhǔn)確性，運(yùn)行周期，操作復(fù)雜度和實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化等方面。
原文：DmitriyKhodakova, 1, ChunyanWanga, 1, David Yu Zhanga, b, Diagnostics based on nucleic acid sequence variant profiling: PCR, hybridization, and NGS approaches，Advanced Drug Delivery Reviews 105 (2016) 3-19.（來(lái)源：生物谷Bioon.com）
關(guān)于艾德生物（股票代碼：300685）
廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司（股票代碼：300685）聚焦在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療分子診斷領(lǐng)域，專(zhuān)注于科技惠民的技術(shù)創(chuàng)新，致力為患者提供合規(guī)、高品質(zhì)的診斷產(chǎn)品和服務(wù)，讓患者從精準(zhǔn)醫(yī)療中真正獲益。公司擁有國(guó)家企業(yè)技術(shù)中心、工信部專(zhuān)精特新小巨人企業(yè)、國(guó)家級(jí)制造業(yè)單項(xiàng)冠軍企業(yè)、博士后科研工作站、發(fā)改委基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用示范中心、國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)、福建省腫瘤高通量測(cè)序工程研究中心等資質(zhì)，GMP標(biāo)準(zhǔn)廠(chǎng)房獲得國(guó)家藥監(jiān)局（NMPA）和歐盟ISO13485資質(zhì)認(rèn)證；公司擁有ADx-ARMS?、Super-ARMS?、ddCapture?、ADx-HANDLE?等核心技術(shù)，核心技術(shù)獲得中國(guó)、美國(guó)、歐盟、日本授權(quán)，榮獲國(guó)家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)、中國(guó)專(zhuān)利獎(jiǎng)銀獎(jiǎng)；公司產(chǎn)品覆蓋具備精準(zhǔn)醫(yī)療條件的各大癌種，多個(gè)產(chǎn)品至今尚無(wú)競(jìng)品，除了在國(guó)內(nèi)三甲醫(yī)院大規(guī)模應(yīng)用外，部分產(chǎn)品在日本、韓國(guó)獲批上市并進(jìn)入當(dāng)?shù)蒯t(yī)保，開(kāi)創(chuàng)了我國(guó)腫瘤伴隨診斷海外獲批的先例。此外，公司下設(shè)廈門(mén)艾德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所、上海廈維醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，擁有醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證、通過(guò)美國(guó)病理學(xué)會(huì)（CAP）認(rèn)證和ISO15189認(rèn)可，專(zhuān)業(yè)從事第三方臨檢服務(wù)。目前全球數(shù)十個(gè)國(guó)家和地區(qū)的客戶(hù)選擇了艾德產(chǎn)品和服務(wù)，每年有數(shù)十萬(wàn)腫瘤患者從中受益。此外，公司瞄準(zhǔn)行業(yè)創(chuàng)新源頭，以伴隨診斷賦能原研藥物臨床，是眾多頂級(jí)藥企腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的戰(zhàn)略合作伙伴，是國(guó)際知名的民族品牌。